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本制品是一种采用了经过改造和优化的BalbRT II M-MLV反转录酶(RNase H-)，用于以总RNA、mRNA等为模板反转录合成cDNA第一链的试剂盒。本试剂盒包含了进行cDNA第一链合成所需的各种试剂。使用本试剂盒合成的第一链，可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR也称定量PCR(qPCR)、cDNA的第二链合成以及cDNA文库的构建等。

本试剂盒中的BalbRT II M-MLV反转录酶(RNase H-)热稳定性高，最适反应温度为42～45℃，但当温度达到50℃时仍具有很高活性，且可获得较高产量的cDNA。试剂盒中提供了RNase Inhibitor，确保在反转录过程中的RNA不会被RNA酶所降解并取得较好的反转录效果。试剂盒还提供了Oligo(dT)18和random hexamer这两种引物，前者适合用于带有Poly(A)尾的mRNA的反转录，后者进行反转录时不需要poly(A)尾。也可以自行采用基因特异性引物进行cDNA第一链的合成。

• 对于GC含量比较高的RNA的反转录，产品的使用说明中都给予了特别说明，请予以关注。
  
• 本制品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
  
• 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

• cDNA第一条链的合成：
  
  • 参考如下表格设置反转录反应(RNase Inhibitor，货号：YT530和dNTP mix，货号：YT391可从百奥莱博订购)：
    

    模板（右侧3种任选其中一种）	Total RNA	0.1ng～5μg
    	或poly(A) RNA/mRNA	10pg～0.5μg
    	或specific RNA	0.01pg～0.5μg
    引物（右侧3种任选其中一种）	Oligo(dT)18 primer	1μL
    	或Random Hexamer primer	1μL
    	或gene-specific primer	15-25pmol
    DEPC-treated Water	－	To 12μL
    选择性步骤：如果模板RNA的GC含量较高(例如大于55%)或者有比较严重的二级结构，混匀后微离心以把液体沉降至管底，65℃孵育5min，随后立即置于冰上冷却，以打开RNA中一些比较稳定的二级结构。
    Reaction Buffer (5X)	－	4μL
    RNase Inhibitor (20U/μl)	－	1μL
    dNTP Mix (10mM each)	－	2μL
    BalbRT II M-MLV反转录酶(RNase H-)	－	1μL
    总体积		20μL

    
    
  • 轻轻混匀(用移液器轻轻吹打混匀或用涡旋混合器在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
    
  • 如果使用Oligo(dT)18或基因特异性引物，42℃孵育60min。如果使用random hexamer(随机六聚体)作为引物，先在25℃孵育10min，随后在42℃孵育60min。
    注意：对于GC含量较高或二级结构比较严重的模板RNA，可以50℃孵育60min，以充分利用本制品中的反转录酶在50℃时仍有良好活性这一特点，在较高温度进行反转录可以有效减少二级结构的干扰。
    
  • 80℃孵育10min以失活BalbRT II M-MLV反转录酶(RNase H-)并终止反转录反应。
    说明：对于5kb以上的长片断cDNA不推荐采用加热的方法失活反转录酶，该方法易导致部分长片断DNA被剪切，此时可考虑酚氯仿抽提或柱纯化方法。
    
  • 反转录产物可以直接用于后续的PCR反应等，也可以-20℃冻存以备以后使用。用于后续PCR反应时，如果PCR的反应体系为20和50μL，则推荐相应地使用0.8和2μL反转录产物。
• 引物延伸、探针标记等其它用途请自行参考M-MLV反转录酶(RNase H-)的相关文献资料进行。

• 总RNA反转录产物电泳观察不到。
  反转录产物由于是从模板反转录而获得，而模板的量本身比较低，反转录的量通常还要少于模板量，并且总RNA的反转录产物大小很不均匀，因此通常总RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不到的。
  
• 反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带。
  
  • PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增，看是否可以成功扩增。如果可以成功，则说明PCR扩增体系没有问题，此时通常是目的基因的引物设计欠佳，当然也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增，则有可能PCR体系存在问题或反转录产物质量欠佳。
    
  • 模板RNA发生了降解。哺乳动物细胞或组织的总RNA琼脂糖电泳后应该可以看到清晰的18S和28S rRNA条带，并且28S rRNA和18S rRNA的亮度比例应该大于等于2.0。如果比例小于2.0，则提示总RNA发生了显著的降解，最好能重新制备总RNA样品。
    避免RNA降解的主要方法是，严格进行RNA的相关操作，包括带洁净手套、戴一次性口罩、在洁净环境中抽提或制备RNA，以尽量避免RNase污染。
    
  • 模板RNA的纯度偏低。在提取纯化RNA的过程中，残留在溶液中的一些成分如苯酚、SDS、EDTA、胍盐、磷酸、焦磷酸、多胺、亚精胺等会抑制反转录酶活性。对RNA样品进行柱纯化，或者进行沉淀、洗涤和再溶解，通常可以有效去除残留的污染物。通常选择使用百奥莱博的BalbZol或Trizol抽提获得的总RNA完全可以满足反转录反应的需要。
    
  • 反转录反应的模板量不足。在抽提获得总RNA后，在进行一些精细的定量检测时通常会进行DNase I消化，以充分去除可能的残留的DNA的干扰。DNase I进行热失活时，需要加入EDTA至终浓度为2.5mM，否则RNA在没有螯合剂的情况下，在加热过程中容易被水解，从而导致模板量不足。此外，扩增特定基因时，需要先查询该基因的组织分布特点，利用其高表达的组织进行目的基因的反转录和克隆。用该基因丰度极低的组织或细胞样品进行反转录和PCR扩增，通常会由于模板量过少而PCR扩增失败。
    
  • 没有使用适当的反转录引物。对于细菌RNA和不含poly(A)尾巴的RNA，要用random hexamer引物代替Oligo(dT)18引物。使用基因特异性反转录引物时，需要确保基因特异性引物设计合理正确。
    
  • 如果RNA模板富含GC或容易形成二级结构，此时可以考虑把反转录温度提高到45～50℃。